ELISA實驗中操作常見問題

如何正確使用酶結合物？
1.酶結合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%BSA或5%脫脂奶粉），通過競爭抑制酶結合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20（0.05%的濃度較為適宜）。
2.正確稀釋酶結合物酶結合物的合適工作濃度需要通過預實驗來確定，濃度過高易導致本底偏高，濃度過低則會導致陽性信號的減弱。酶結合物在使用前稀釋，稀釋后的酶結合物不宜保存，因為低濃度的酶結合物極易失活。

如何選擇合適的陽性對照？
陽性對照的基本組成應該盡量與檢測樣本的組成一致，一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，加入一定量的待檢物質。比如，以人血清為標本的測定，陽性對照多用確定的病人血清或者以復鈣人血漿為原料加入一定量標準品。如何選擇合適的陰性對照？陰性對照的基本組成也應該盡量與檢測樣本的組成一致，先行檢測確定其中不含待檢物質。比如，檢測人血清標本時，陰性對照應該選擇正常人血清；檢測免疫動物血清中抗體效價時，陰性對照應該選擇該動物的免疫前血清。
如何選擇*化的包被條件？
1.包被抗原的選擇
包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應的物質如抗體直接吸附在酶標板上，再通過特異性反應使抗原固相化）。經純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標板上，一般都先使其與無關蛋白質如BSA等偶聯，偶聯物吸附于固相載體上。
2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。
3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。
4.包被濃度的選擇包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質變化，一般蛋白質的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過實驗來確定。包板后需要封閉嗎？應該選擇什么樣的封閉體系？封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經封閉也可得到滿意的結果。而在間接法測定中，封閉一般是*的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART使用5%脫脂奶粉，價廉而且封閉能力強，不過5%脫脂奶粉只適合短期內使用，不宜保存，所以ELISA試劑盒中較少使用。