17羥孕酮Elisa試劑盒HRP的氧化耦聯色原底物對主要有4—氨基：耦聯底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存在下，4—氨基和經HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收。
該耦聯色原底物對用于固相ELISA時，敏感性一般較低，反應見光不穩定，而且易發生多聚化，缺乏適當的反應終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標的酶法檢測應用。1989年日本學者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應。但這種方法僅停留在實驗室階段，其后也未見有其他實驗室的應用報道，可能還有其固有的缺陷。
4—氨基：耦聯底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基以2 mmol／L，以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2），即可應用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），zui大吸收波長為590nm，見光不穩定。用鹽酸或硫酸終止反應后，pH應為3．0左右，pH值的降低使顯色從紫藍色轉變為清晰的藍色，zui大吸收波長從590nm變為595nm，然而pH值的進一步降低，將導致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。
堿性磷酸酶（AP）
在17羥孕酮Elisa試劑盒測定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對硝基苯磷酸鹽。在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酚（），其在入＝405 nm處有zui大吸收.
由于堿性條件下的光吸收增強，并可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因為單乙醇胺對堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無機磷可競爭性地抑制堿性磷酸酶的活性，貯存時間過長由于非酶水解而產生硝基酚和磷酸鹽時即可出現這種情況，此時呈黃色。
因此，用于ELISA測定時，必須五色。的摩爾消光系數（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強度、蛋白含量，當溫度從15~C升高至45℃時，在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。
在17羥孕酮Elisa試劑盒測定時，色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將以10 mmol／L的濃度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺緩沖液（pH 9．8），即可應用；②終止液：0．5 mol／L碳酸鈉；③測定波長：405nm。