大鼠視網膜Müller細胞永生化細胞操作步驟

** 細胞轉染與篩選**

完成細胞培養和預處理后，將構建好的SV40大T抗原表達質粒通過脂質體轉染法導入原代Müller細胞。轉染48小時后，更換為含400μg/mL G418的選擇培養基進行抗性篩選，持續2-3周直至未轉染細胞死亡。期間需每3天更換一次篩選培養基，并密切觀察細胞狀態。注意設置未轉染細胞作為陰性對照，以確認篩選效果。

**單克隆分離與擴增**

采用有限稀釋法進行單克隆分離：將篩選后的細胞懸液稀釋至0.5個細胞/100μL，接種于96孔板，每孔加入100μL培養基。培養1周后標記單個細胞形成的克隆，待克隆長至孔底50%面積時，用克隆環法分離并轉移至24孔板擴大培養。此過程需特別注意無菌操作，建議每個克隆保留3個備份。

**永生化驗證**

通過以下方法驗證細胞永生化特性：

1) RT-PCR檢測SV40大T抗原mRNA表達；

2) Western blot檢測大T抗原蛋白表達；

3) 連續傳代觀察：永生化細胞應能穩定增殖超過50代，而原代細胞通常在10代左右出現衰老；

4) 生長曲線測定：繪制細胞倍增時間曲線，永生化細胞應保持穩定增殖速率。

** 功能特性鑒定**

為確保永生化細胞保持Müller細胞特性，需進行：

• 免疫熒光染色檢測特異性標志物（GS、CRALBP、Vimentin）

• 合成酶活性測定

• 鉀離子緩沖功能檢測

• 對視網膜神經元條件培養基的反應性測試

**細胞凍存與復蘇**

鑒定合格的細胞系按1×10^6細胞/mL密度凍存于含10%DMSO的培養基中，程序降溫后轉入液氮保存。復蘇時采用37℃快速水浴法，離心去除凍存液后重懸于新鮮培養基。建議前3代細胞每代凍存5-10支備份。

**注意事項**

1. 所有操作需在二級生物安全柜中進行

2. 不同批次血清需預先進行細胞生長測試

3. 定期檢測支原體污染

4. 建議使用低代次細胞（10-30代）進行實驗

5. 原始細胞株應分開保存避免交叉污染