在繼續(xù)介紹Hela S3人宮頸癌細(xì)胞株的操作步驟時，我們需格外注意無菌操作與細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。接下來，將詳細(xì)闡述細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存的關(guān)鍵步驟：

 細(xì)胞復(fù)蘇

1. **預(yù)熱培養(yǎng)基**：將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中預(yù)熱，確保溫度適宜細(xì)胞生長。
2. **快速解凍**：從液氮罐中迅速取出凍存的Hela S3細(xì)胞，立即放入37℃水浴中，輕輕搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化。
3. **離心洗滌**：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，加入等體積預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕混勻后，以800-1000rpm的速度離心5分鐘，棄去上清以去除DMSO。
4. **重懸接種**：向細(xì)胞沉淀中加入適量預(yù)熱的培養(yǎng)基，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，隨后接種至已預(yù)先用培養(yǎng)基潤洗的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

- **日常觀察**：每日使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)及培養(yǎng)基顏色，適時更換新鮮培養(yǎng)基，防止細(xì)胞污染和營養(yǎng)耗盡。
- **換液**：通常每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。

 細(xì)胞傳代

1. **消化處理**：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞一次，加入適量的消化液，置于培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞開始變圓并脫落。
2. **終止消化**：加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落并分散成單細(xì)胞懸液。
3. **細(xì)胞計數(shù)與分盤**：取少量細(xì)胞懸液進行計數(shù)，根據(jù)實驗需要調(diào)整細(xì)胞密度后，接種至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存

1. **準(zhǔn)備凍存液**：按培養(yǎng)基:血清:DMSO = 7:2:1的比例配制細(xì)胞凍存液，置于4℃預(yù)冷。
2. **細(xì)胞收集**：同細(xì)胞傳代中的消化處理步驟，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。
3. **重懸與凍存**：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，逐滴加入預(yù)冷的凍存液，邊加邊輕輕晃動，使細(xì)胞均勻分散。隨后，將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃冰箱過夜，最后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

通過以上細(xì)致的操作步驟，可以確保Hela S3人宮頸癌細(xì)胞株在實驗室中的穩(wěn)定傳代與高效利用。